Als kunst- und kulturgeschichtliches Museum liegt der Sammlungsschwerpunkt des Rosgartenmuseums auf Objekten, Kunstwerken und Zeugnissen der Geschichte der Stadt Konstanz und der Bodenseeregion.
Grundstock ist die Sammlung des Museumsgründers Ludwig Leiner, sowie weitere private Sammlungen, die 1870 mit der Gründung des Rosgartenmuseums als städtisches Museum zusammengeführt wurden.
Über die Jahrhunderte ist die Sammlung kontinuierlich angewachsen und umfasst derzeit ca. 200.000 Objekte. Sie Sammlungsbreite reicht von archäologischen Funden aus der Jungsteinzeit über mittelalterliche Altargemälde und sakrale Holzschnitzereien, Gemälde von Konstanzer Künstlern und Alltagsobjekten des 19. und 20. Jahrhundert bis hin zu privaten Briefen und Fotografien von historischen Persönlichkeiten.
Die Sammlung wird stetig erweitert um Objekte und Kunstwerke, die einen Bezug zur Geschichte und Kultur der Stadt Konstanz haben.